任丽丽:新型冠状病毒病原学研究对临床的提示(3)
第二,血清学方法,包括中和试验、补体结合试验、红细胞凝集/抑制试验等,检测病毒蛋白和宿主感染后的病毒特异性抗体;现代发展的免疫学分析方法,包括酶联免疫和免疫荧光方法等,检测病毒抗原、IgM和IgG抗体等是对经典血清学方法的补充。这些方法具有较强特异性,但敏感性不足。其中,中和试验是判断病人是否产生能够中和病毒的抗体,需要使用活病毒,在生物安全III级实验室操作。
第三,分子生物学技术,新冠疫情让大家熟知的聚合酶链反应就是常用的核酸分子生物学技术,此次病毒鉴定使用的高通量测序方法也是当前病原学检测上应用的技术。
第四,电镜技术,用于病毒形态学鉴定和观察,高技术依赖性,需要电镜设备。
这些检测方法各有优缺点,在方法学的使用上要根据实际情况选择。虽然我们做了很多年的病毒病原学研究,做了大量的核酸检测,但是做呼吸道病毒的核酸检测,既往在三甲级医院等医疗机构并没有实现常规检测。在当前常需要进行核酸大规模检测情况下,应高度关注核酸气溶胶污染,这对于实验室空间要求和个人技术能力等的要求很高。发展通量自动化核酸提取和检测平台,推进非核酸提取方法的封闭式的快速检测平台都是核酸检测方面亟待发展的内容。希望这次的新冠疫情能够作为一种助力,推动快速检测技术的发展。
监测病毒基因组的突变
病毒核酸检测要求检测引物序列与病毒基因组序列的匹配,新冠病毒的基因组为RNA,在自然演化和在群体免疫压力下是不断发生适应性突变。在国家基因组科学数据中心和国际多个数据网站上都可实时更新基因组突变情况。监测突变可以帮助我们去发现检测核酸的引物靶向基因区域是否发生突变,会不会容易产生脱靶的现象。毒株序列在其流行早期被分为S和L型,2020年1月7日前后,在武汉和非武汉地区S型别的分布呈现显著差异;经过全球近半年的流行适应,核蛋白基因R203K和G204R的突变株在全球多地出现;刺突蛋白基因D614G的突变株逐渐成为主要流行毒株,这一毒株被认为具有更快的传播能力。因此,对突变的监测不仅对检测方法的优化有重要作用,更是发现新的传播特性毒株、评估病毒流行特征的关键。
对突变的监测也可以从人体内突变分析角度来进行。群体中出现的突变病毒基因组,是病毒在个体内复制和群体间传播选择过程中逐渐形成的优势毒株。病毒人体中每复制一次,会产生0.01~0.0001个位点出现突变,这种突变与病毒聚合酶纠错功能不足和个体免疫压力的选择有关。因此,每个病人体内带有具有不同突变位点的基因组序列,称之为病毒准种。个体内不断选择形成的最有复制和传播优势的毒株逐渐形成了群体优势毒株。因此,对新冠病毒的宿主体内的突变监测,可有助于对群体流行株突变演化提供参考数据。
基于体液免疫反应特点建立检测体系
抗原交叉反应分析
核酸检测并不是完美的,受到了很多因素的制约,如样本采集的质量、储存运输温度和检测灵敏度等,还受到不同感染病程的影响。基于此,我们团队较早提出联合应用IgM抗体检测提高感染病例的检出氯。建立抗体检测方法需要要先找到特异性的抗原,这个抗原不能与其他病毒抗体有交叉反应,否则就不知道检测出来的抗体是A病原引起,还是B病原引起。经过分析,发现新冠病毒只和SARS的N蛋白有反应,但是当年在SARS期间只感染了8000多人,而且他们不可能是IgM阳性了。所以当时我们用N蛋白去检测IgM的抗体。随后方法学上的不断积累发现联合N和S蛋白能够进一步提高灵敏度。因此,对于核酸检测阴性的病例,联合检IgM抗体分析,有助于发现早期感染病例。
SARS-CoV-2感染患者抗体特征
血清IgM、IgG抗体检出率与PCR阳性率
从抗体的流行特征上来看,如图所示,黑线是PCR检出的阳性率,红线是IgM的检出率,绿线是IgG的检出率。症状出现后1~3天时,PCR阳性率为>90%,6天时下降到80%以下,14天时下降到50%以下;前5.5天,PCR法的阳性检出率高于IgM ELISA法,而在症状出现5.5 d后,IgM ELISA法的阳性检出率高于PCR法。
抗体检测辅助COVID-19诊断
左图显示的是在PCR检测阳性的患者中,IgM阳性的患者占75.61%,阴性占24.39%;在PCR检测阴性的患者中,IgM检出率达到了93.1%。