任丽丽:新型冠状病毒病原学研究对临床的提示
有关新冠病毒病原学存在的许多未解问题,目前还无法给出一个100分的答案。今天主要和大家交流新冠病毒从病原学的角度进行了哪些研究,这些研究给临床带来哪些提示,特别提到的是在病毒检测方面如何选择方法。从2005年开始,国内团队开展了系统的呼吸道病毒病原学研究,积累了核酸、抗体等检测方法和经验,在新冠病毒检测中这些技术能够在病原鉴定和病原学研究中充分发挥作用。
一、它是谁?
病原学的问题可总结为「六大问题」。第一个问题,它是谁?当发现一个不明原因肺炎或者其他的不明原因感染,它到底是由什么病原引发?
把发现过程整理成文章是重要的「复现」过程,实际上是展示完整的链条——
如何确定新冠病毒就是疫情的病原体。
这四篇文章中除了有一篇在早期发表,其他三篇文章都是按照要求在1月20日之后发表在各个杂志。当时国内有几个团队按照任务要求同时开展鉴定工作,很快就都锁定了一种新型冠病毒为此次疫情病原。知道它是谁,那么病毒通过何种方式感染细胞?感染哪些组织细胞?病毒传播过程中如何变化?人感染之后的症状是什么样?如何防治?我们针对上述几个问题逐一探讨。
二、新型冠状病毒的发现
十余年前,当我们遇到不明原因肺炎等疾病时,鉴定病原常是猜测排除法。近些年,分子检测技术不断发展,未知病原鉴定技术体系随之不断完善,如此次鉴定新冠病毒鉴定的团队均采用不同的深度测序技术快速获得病毒的基因组序列,结合病毒学经典的技术方法,即病毒的分离培养、病毒抗体和抗原等免疫学特征等来确定新冠病毒是感染病原体。体现在新冠病毒鉴定的文献里,能看到基因组序列特征、分离的病毒引起的细胞病变效应、病毒在电镜下的形态学特征,人体特异性抗体的产生等结果为鉴定依据。其中感染病例血清抗体特征以外周血抗体4倍增高为依据来判定是否有病毒感染等。这些方法都是病毒病原学研究常用的检测方法,在所有检测鉴定方法中分子检测仍是较快速的,可以帮助我们快速病毒筛查;病毒分离培养等病毒学上的「金标准」检测方法耗时长。
新冠病毒发现以后,从感染症状上来看,部分病人会出现严重急性呼吸综合征,据此命名为SARS-CoV-2。根据基因组序列特征,新冠病毒的组成与SARS等冠状病毒家族成员比较接近,从5'端开始前2/3的区域都是编码病毒聚合酶的基因,后1/3是编码包括刺突蛋白、包膜蛋白、膜蛋白和核衣壳蛋白等病毒主要结构蛋白,在这些结构蛋白中穿插着小的开放读码框编码非结构蛋白,这些非结构蛋白是拮抗宿主天然免疫反应,诱导宿主焦亡或者凋亡的重要蛋白分子。
验证满足Koch法则
从发现新冠病毒以后,我们会看到很多通过自媒体或官方媒体等渠道发布的信息,如「某地方测了一条序列,已经证实为××」,这是非常不严谨的说法。要证实一个新发疾病病原,不是有点序列就可以判断,即使从基因组特征确认了新型冠状病毒基因序列的存在,判定其为感染病原但仍需遵循科赫法则。
对于新冠病毒来讲,我们团队与中国医学科学院医学实验动物研究所的老师合作,很快就把这一条链条形成一个闭环的证据全部拿到。从基因组与生物信息学的角度来看,我们知道这是冠状病毒序列,在细胞上分离出来新冠病毒,也可以明确其冠状病毒的形态,那它到底是不是致病病原呢?
这组实验,是在前面已经确定病毒基因组特征、分离到病毒的情况下,用病毒分离株感染转人类ACE2基因小鼠,能够看到实验小鼠体重下降,肺部炎症的表现,病毒S蛋白和hACE2受体被发现共定位于肺泡上皮细胞,最关键的是
从小鼠的感染组织中分离出新冠病毒,经过基因组测序与感染的毒株序列基本一致。
这个过程在文章中是很简单的一张图片,但拿到一张满意的图片难度还是比较大,记得负责电镜检测的老师用了一个通宵拿到这张图片。上述提到的四点就是经典的科赫法则,我们把链条完美地呈现出来,就可以确定它就是导致新冠肺炎的病原。
第七个可感染人冠状病毒
上图为感染人类的冠状病毒的家族谱,图中红字都是可感染人冠状病毒。从1966年人冠状病毒229E和1967年人冠状病毒OC43发现以来六十余年时间,我们只认识2种可感染人冠状病毒。2003年的SARS-CoV出现,SARS之后的2004年,港大的袁国勇教授以及荷兰的学者发现两个新型可感染人冠状病毒,即HKU1、HCoV-NL63。随后,又过了约8年的时间,在2012年发现了MERS-CoV。在2019年,又出现了SARS-CoV-2。所有的人类冠状病毒都是跨种来源。2003年后由于溯源需要,在蝙蝠等野生动物体内鉴定出多种动物冠状病毒,能否从动物体内早期鉴定出可能感染人类的病毒,这是病原学研究中重点关注的内容。积累的冠状病毒基因组特征等数据也为后续寻找病毒演化特征提供了必备的基础参考数据。